Comment les embryons survivent-ils au processus de congélation ?

Barry Behr est professeur adjoint d’obstétrique et de gynécologie et directeur des laboratoires de fécondation in vitro (FIV) à l’université de Stanford et directeur de laboratoire consultant pour les centres de reproduction Huntington. Il s’est entretenu avec Sarah Graham, rédactrice associée de SciAm.com. Une transcription éditée de leur conversation suit :
SA : Quel est le processus utilisé pour la congélation des embryons ?

La congélation des cellules existe depuis des décennies. La préoccupation majeure dans la cryoconservation des cellules est la formation possible de cristaux de glace à l’intérieur dans les cellules. On peut imaginer qu’ils sont comme des petites lames de rasoir à l’intérieur d’un ballon : les cristaux de glace ont des angles aigus et des petites pointes. Ils peuvent donc endommager la membrane d’une cellule ou les membranes de diverses structures cellulaires qui existent à l’intérieur du cytoplasme des cellules. Ceci est vrai pour toutes les cellules, qu’il s’agisse d’embryons, de steaks, de poissons, de fruits ou de légumes. En fait, la plupart des gens peuvent ressentir les effets de la cryoconservation lorsqu’ils goûtent un morceau de poisson qui a été congelé par rapport à du poisson frais. Il est généralement plus dur, son goût est moins bon et il présente des caractéristiques négatives qui le distinguent du poisson frais. Et cela est dû à la mort cellulaire. Les structures naturelles qui existent entre les cellules ou à l’intérieur des cellules sont endommagées pendant le processus de congélation-décongélation, ce qui altère la saveur ou la texture du tissu. C’est pour ces raisons que des sceptiques comme moi ont exprimé une inquiétude au sujet de la congélation d’organes entiers, car il est très difficile d’appliquer le matériau protecteur dont les cellules ont besoin pour survivre à de grands tissus ou de grands organes ou parties du corps.

Ce qui nous amène à la congélation des œufs, des embryons ou du sperme. L’embryon le plus avancé que nous congelons se situe entre 100 et 120 cellules, ce que l’on appelle un blastocyste. Sa taille est d’environ 120 microns, soit environ un dixième de millimètre, ce qui le rend très propice à la congélation et à l’utilisation de cryoprotecteurs. Les cryoprotecteurs sont essentiellement des antigels que nous ajoutons aux solutions dans lesquelles les cellules sont congelées afin de les protéger des dommages causés à la membrane et aux cristaux de glace. Ils sont conçus à la fois pour pénétrer dans les cellules et pour déplacer l’eau afin d’empêcher la formation de cristaux de glace intracellulaires. Ils ont une deuxième fonction, celle de stabiliser la membrane et de la protéger des dommages pendant la cryoconservation. Et troisièmement, ils fournissent un environnement « hyper-osmotique » qui favorise le processus de déshydratation, qui extrait l’eau des cellules. Ce processus est réalisé en utilisant des cryoprotecteurs composés de grosses molécules de sucre qui forment une solution plus concentrée autour des cellules, ce qui, par osmose et diffusion, fait sortir l’eau. Simultanément, les cryoprotecteurs composés de molécules plus petites, comme l’éthylène glycol ou le glycérol, sont capables de pénétrer dans la cellule afin qu’elle ne se rétracte pas comme un raisin sec. Au contraire, elle peut conserver sa structure tridimensionnelle jusqu’à un certain point, mais sans être remplie d’eau. Parce que nos cellules sont composées principalement d’eau, si nous les déshydratons au point de ne plus avoir de fluide, elles seraient endommagées par ce qu’on appelle les effets de solution, qui résultent du fait que la cellule est trop concentrée et que son eau n’est pas remplacée par un autre composé.

La déshydratation est l’une des étapes clés de la cryoconservation. Il est important de garder à l’esprit que la raison pour laquelle ce processus est si efficace pour les embryons et les spermatozoïdes est due à leur taille et à leur nombre relativement faible de cellules. Un foie ou un rein comporte des milliards de cellules et une grande structure tridimensionnelle. Un dixième de millimètre est relativement petit, en revanche, même si c’est toujours grand à un niveau microscopique.
Il existe une technologie émergente appelée vitrification qui diffère de la cryoconservation traditionnelle par refroidissement lent ou congélation lente. La méthode traditionnelle nécessite l’ajout séquentiel de cryoprotecteurs sur une série de 10 à 20 minutes, puis un processus d’environ deux heures qui refroidit les cellules à environ 0,3 à deux degrés par minute jusqu’à -196 degrés Celsius, qui est la température de l’azote liquide. La raison pour laquelle le refroidissement se fait lentement est de permettre la perméation des cryoprotecteurs et la déshydratation appropriée des cellules de manière à ce qu’aucun cristal de glace intracellulaire ne se forme.
La vitrification, cependant, est une technique qui utilise des concentrations beaucoup, beaucoup plus élevées de cryoprotecteurs – environ trois à quatre fois plus élevées. Mais le taux de refroidissement est 10 000 fois plus rapide. Nous refroidissons donc les organismes à un rythme de 10 000 à 20 000 degrés par minute en les plongeant directement dans l’azote liquide. Le refroidissement rapide est nécessaire pour deux raisons : éviter la toxicité des niveaux élevés de cryoprotecteurs à température ambiante et réaliser la vitrification, c’est-à-dire la formation de verre. Par définition, la vitrification est une solidification par augmentation de la viscosité. Ainsi, au lieu de passer d’un état liquide à un état solide, il y a formation de verre, ce qui permet de conserver les cellules dans leur état actuel sans passer par la déshydratation complète que l’on obtient avec un refroidissement lent. Mais cette méthode présente quelques problèmes. Tout d’abord, la forte concentration de cryoprotecteurs nécessaire suscite des inquiétudes. Plus important encore, le seul moyen d’obtenir le taux de refroidissement requis est de mettre les cellules en contact direct avec de l’azote liquide, et l’azote liquide peut être un vecteur de transmission de maladies. La vitrification est très utilisée au Japon et dans quelques endroits aux États-Unis, mais il n’existe actuellement aucun système ou milieu de vitrification approuvé par la FDA dans ce pays. En revanche, il existe de nombreuses solutions cryoprotectrices traditionnelles que vous pouvez acheter auprès de vendeurs agréés par la FDA. Ainsi, bien que la vitrification soit un peu problématique et qu’elle n’ait pas encore donné de résultats supérieurs, elle est bien supérieure sur le plan temporel. Elle ne nécessite pas non plus d’équipement coûteux capable de refroidir les chambres à un tiers de degré par minute. Il faut une machine de 10 000 à 20 000 dollars pour cela, alors qu’il s’agit essentiellement d’un seau en polystyrène dans lequel on verse de l’azote liquide. Cela présente des avantages théoriques mais ce n’est pas encore sorti de l’auberge.

SA : Combien de temps prend le processus de cryoconservation traditionnel ?
La méthode standard prend environ deux heures. La température négative de 196 degrés C est proche du zéro absolu, mais ce n’est pas le zéro absolu, qui est la température théorique à laquelle aucune activité biologique ne se produit. C’est certainement assez proche pour arrêter l’activité biologique et permettre la naissance de bébés à partir d’embryons congelés depuis 14 ans. Quatorze ans est la durée la plus longue – à ma connaissance – pour un embryon congelé qui a donné lieu à une naissance vivante.

SA : Y a-t-il des limites à la durée de conservation des embryons ?
C’est théoriquement beaucoup plus long que… Cela devrait être un siècle ou deux, même, bien qu’il ne soit pas déraisonnable de penser qu’il y aurait une certaine dégradation avec le temps. Nous avons beaucoup appris sur la cryoconservation depuis la première congélation d’embryons il y a environ 20 ans. Les embryons qui ont été congelés à l’époque auraient pu tous être utilisés – les gens n’attendent généralement pas 14 ans pour avoir des enfants. La nature de la reproduction et de la construction des familles ne favorise pas vraiment un environnement qui vous permettrait d’attendre 50 ans avant de décongeler vos embryons. À moins que votre fille ne veuille porter son frère ou sa sœur, par exemple, ce qui est théoriquement possible : une personne née d’une FIV peut encore avoir des embryons de son frère ou de sa sœur congelés et, lorsqu’elle atteint 30 ans et qu’elle est infertile, elle pourrait techniquement décongeler les embryons qui ont été créés au même moment qu’elle, les mettre en gestation et accoucher de son frère ou de sa sœur. Cela ne s’est pas encore produit mais cela pourrait être possible.

SA : Comment sont traités les embryons avant leur utilisation ou leur implantation ?

C’est essentiellement le processus inverse. Les facteurs clés qui doivent être atteints lors de la décongélation sont la réhydratation de la cellule sans la faire exploser. Nous les réchauffons à l’air et au bain-marie plutôt que dans une machine et le taux de réchauffement est moins précis et beaucoup plus rapide que le taux de refroidissement. Les embryons passent par un certain nombre d’étapes pour diluer lentement les cryoprotecteurs ajoutés lors de la congélation. Il s’agit d’une dilution progressive du cryoprotecteur à mesure que les cellules sont réchauffées à la température ambiante, puis à la température du corps. On les laisse ensuite essentiellement se reposer et elles sont généralement implantées dans les deux à quatre heures qui suivent leur arrivée à la température du corps.

En guise de remarque, la congélation réussie du sperme a été réalisée bien avant tout autre type de congélation cellulaire. Les spermatozoïdes peuvent être congelés facilement car ils n’ont pas de cytoplasme et ne sont donc pas sensibles à tous les types de dommages mentionnés précédemment.
SA : Quels sont les chiffres sur les taux de réussite de la FIV avec des embryons congelés ?
Le premier bébé issu d’un embryon cryoconservé est né en 1986. Le taux de réussite de la FIV avec des embryons congelés est d’environ deux tiers de ce qu’il serait avec des embryons frais. Il est difficile de donner un chiffre définitif, car cela dépend des matières premières avec lesquelles on travaille. Le taux de grossesse est déterminé principalement par l’âge, donc si vous avez 40 ans, vos chances sont bien pires que ce qu’elles étaient à 30 ans, par exemple.

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