Structure of the Ebola virus glycoprotein spike within the virion envelope at 11 Å resolution

Um eine genauere Struktur für den nativen Spike innerhalb des EBOV-Partikels zu erhalten, analysierten wir gereinigtes bona-fide EBOV, um den GP-Spike innerhalb der Virionenhülle abzubilden (Abb. 1a,c). Diese GP-Spike-Bilder wurden nur mit der Einzelpartikel-Methode analysiert (Abb. S1, S2), um sie mit Strukturen zu vergleichen, die zuvor von uns und anderen mit tomographischen Methoden erhalten wurden. Es wurden Diskrepanzen zwischen den Strukturen des gesamten, nicht verkürzten EBOV-GP beobachtet, die mit Material bestimmt wurden, das mit unterschiedlichen heterologen Expressionssystemen hergestellt wurde, sowie zwischen den Strukturen, die mit alternativen tomographischen oder Einzelpartikel-Methoden der dreidimensionalen Bildverarbeitung erhalten wurden 4,28. Aufgrund von Sicherheitsbedenken wurde das Viruspräparat mit Paraformaldehydvernetzung (nach Zentrifugation) in einem Protokoll behandelt, das nachweislich die Protein- und Lipidstrukturen erhält4,30. Ebola-Virionen sind flexibel, und virale Filamente sind häufig gekrümmt, wenn sie im gefriergetrockneten Zustand für die Kryo-Elektronenmikroskopie präpariert werden (Abb. 1b). Daher wurden für die Bildverarbeitung möglichst gerade Regionen von Virionen ausgewählt (Abb. 1c). Unsere Daten umfassten 32.960 einzelne Spike-Bilder für die Einzelpartikelanalyse. Zusätzlich wurden 29.976 Bilder für die referenzfreie Analyse des halben Durchmessers von EBOV ausgewählt, um die räumliche Verteilung der GP-Spikes sowie die Periodizität und symmetrischen Beziehungen zwischen GP und dem Matrixprotein VP40 in der Hülle und der darunter liegenden Nukleokapsidschicht zu untersuchen (Abb. 1c und S3).

Abbildung 1

Elektronenmikroskopie von (a) Negativ gefärbtem EBOV, (der Einschub zeigt das Virus bei höherer Vergrößerung). Es wurde eine Defokussierung von 2-3 Mikrometern verwendet, so dass die Spikes bei geringem Kontrast sichtbar sind. Die gelben Pfeile weisen auf einzelne GP-Spikes hin. (b) Kryo-EM von EBOV, schwarze „Punkte“ sind 10 nm kolloidales Gold, das zur Fokussierung hinzugefügt wurde. (c) Höhere Vergrößerung zeigt einzelne GP-Spikes (gelbe Kreise), die Virushülle ist durch weiße Klammern gekennzeichnet. Das rote Quadrat zeigt die relative Größe der Bilder mit halbem Durchmesser, die für die symmetrische Analyse der Bildverarbeitung in der ergänzenden Abb. S3 verwendet wurden. Das weiße Quadrat zeigt die relative Größe der Bilder, die für die Bildverarbeitungsdaten in der gezeigten Abb. 2 und der ergänzenden Abb. S2 verwendet wurden.

Eine 3-D-Struktur für das GP-Spike-Trimer in situ, innerhalb der Virushülle, mit einer Auflösung von 11 Å wurde berechnet (Abb. 2 und 3, ergänzende Abb. S4), indem das Projection-Matching-Verfahren auf maskierten Bildern angewendet wurde31,32. Es gelang uns, die atomare Struktur des EBOV-GP (5JQ7) anzudocken, die die GP1- und GP2-Domänen in voller Länge enthält, wobei die mucinartigen Domänen jedoch abgeschnitten sind (Abb. 2b). Dies zeigt deutlich eine Reihe von Merkmalen des vom Virus stammenden Spikes, einschließlich der Struktur und Anordnung der muzinartigen Domänen in Bezug auf die GP1-GP2-Struktur. Insbesondere die Basis des Spikes, die aus den GP2-Fusionsdomänen mit den Heptad-Repeat-Motiven besteht, passt extrem gut: Die atomar aufgelöste Struktur 5JQ7 füllt das Volumen unserer 3-D-Kryo-EM-Struktur aus (Abb. 2a). Die gute Übereinstimmung, insbesondere im Bereich des Stiels oder „Halses“ des GP-Trimers, wird deutlich, wenn die Spike-Struktur in einer Dichte dargestellt wird, in der die 5 nm dicke Doppelschicht der Virionenhülle deutlich sichtbar ist (Abb. 2a,c und 3a), und auch, wenn die Oberfläche so weit abgeschnitten wird, dass das Volumen ungefähr einem Molekulargewicht von 310 kDa entspricht (Abb. 2 und 3b). Die Alpha-Helices von GP2 sind an der Basis des Spikes sichtbar (Abb. 2a), und wenn die Rekonstruktion auf einem etwas höheren Konturniveau dargestellt wird, sind Dichten sichtbar, die das Innere der Membran durchqueren (Abb. 2c). Da die N-terminalen Enden der angedockten alpha-5-GP2-Domänen (2EBO24) mit diesen Transmembrandichten übereinzustimmen scheinen, könnten letztere ein Hinweis auf die mutmaßlich hydrophoben alpha-helicalen Transmembranbereiche von GP2 sein (Abb. 2c). Anhand der vorhergesagten Masse des GP (gemessen durch Gelelektrophorese von aus Virionen gewonnenem GP33) haben wir das Volumen der 3-D-Struktur in Abb. 2 angepasst, wobei wir einen Wert von 0,8 Da/Å3 als ungefähre Dichte für das Protein annahmen34. Da die Struktur 5JQ7 eine Größe von 163 kDa hat35 , entsprechen die verkürzten muzinartigen und transmembranen Domänen, einschließlich der Glykane, etwa 150-170 kDa, also etwa der Hälfte der Masse des Spikes. Von oben betrachtet, sieht der GP-Spike wie ein dreiblättriger Propeller aus (Abb. 2a und 3b). Die Länge der drei „Blätter“ umschließt einen Kreis mit einem Durchmesser von 18 nm. Von der Seite betrachtet hat der GP-Spike einen Stielbereich, der an die Virushülle angrenzt und sich dann zum oberen Teil des GP-Spikes ausbreitet. Die in 5JQ7 identifizierte Toremifen-bindende „Tasche“ oder der „Tunnel“ befindet sich in der Nähe der Oberfläche der 3-D-EM-Struktur, auf der Seite des Stiels an der Basis der Propeller (Abb. 2a und 3b). An der Basis des Stiels in Abb. 2a passen die drei sich wiederholenden Heptad-Helices an der Basis von GP2 genau in drei Stränge, die in unserer EM-3-D-Struktur sichtbar sind und die Virionmembran zu durchdringen scheinen (Abb. 2a und 3a). In der Draufsicht hat jedes Blatt einen kleineren Knubbel, der näher an der 3-fach-Achse liegt und nach distal ragt (Abb. 2a und 3b). Bei Verwendung der 332 kDa-Konturebene entsprechen diese Noppen genau der Rezeptorbindungsstelle und decken die meisten der bekannten, an der Bindung beteiligten Reste ab. Jedes Propellerblatt, von dem bekannt ist, dass es die muzinartige Domäne28 enthält, bedeckt vollständig die Stelle, von der bekannt ist, dass sie an den NPC-1-Rezeptor bindet (Abb. 3b). Somit besteht etwa die Hälfte der Masse in unserer Struktur außerhalb der Hülle aus den mucinartigen Domänen. Wenn die Dichtekarte auf eine Ebene konturiert wird, die die Lipiddoppelschicht aus der Darstellung entfernt, entspricht der Stiel immer noch genau der Oberfläche der atomar aufgelösten Struktur, während die distalen Enden der Lamellen und die Glykankappen-„Noppen“ leicht abgeschnitten sind. Wir haben auch die 5JNX-Struktur36 angedockt, die einen Teil des gespaltenen Glykoproteins (GPcl) im Komplex mit menschlichem NPC1 in voller Länge enthält, und die atomar aufgelöste Struktur mit dem Programmmodul „Fit in Map“ in UCSF Chimera auf ein Monomer übertragen (Abb. 3a). Dies deutet darauf hin, dass die muzinartige Domäne (die gesamte unbesetzte Dichte, die in der 3-D-EM-Struktur verbleibt, wenn GP1-GP2 eingepasst werden) die Glykankappe vollständig bedeckt, wobei der Nub an der Seite des Propellers den größten Teil, wenn nicht sogar die gesamte Rezeptorbindungsstelle bedeckt (Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass die Entfernung oder Spaltung der muzinartigen Domäne (wahrscheinlich einschließlich des Nubs) sowie der Glykankappe eine Voraussetzung für die Rezeptorbindung sein kann. Die angedockte 5JNX-Struktur umfasst auch die Transmembranregion von NPC1, so dass wir die ungefähre Ebene der Plasmamembran beim Andocken des GP-Spikes an den Rezeptor NPC1 ausrichteten (in Abb. 3a in transparentem Blau dargestellt). Ohne jegliche Biegung der endosomalen Membran, um die Kontur des GP-Trimers und des NPC1-Komplexes aufzunehmen, würde die Ebene der Plasmamembran einen Winkel von etwa 18 Grad zur viralen Membran bilden, wenn der Spike senkrecht zur Virushülle steht (Abb. 3a). Dies stimmt mit der Vermutung von Gong et al.36 überein, dass vielleicht nur eine von drei NPC1-Rezeptor-Bindungsstellen auf jedem Trimer gleichzeitig besetzt sein kann, und dass die Bindung an mehr als einen Rezeptor aufgrund von Stearinsäure-Interferenz ausgeschlossen sein könnte. Die mögliche Spaltlinie, die die mucinartige Domäne und die Glykankappe vom Rest des Trimers abgrenzt, ist in Abb. 3a und b dargestellt. Unsere Struktur deutet darauf hin, dass die mucinähnliche Domäne und die Glykankappe gleichzeitig gespalten werden könnten, da letztere vollständig innerhalb der Dichte der mutmaßlichen mucinähnlichen Domäne liegt, und steht im Einklang mit einem Molekulargewicht der mucinähnlichen Domäne von etwa 50 kDa, das dem durch die Sequenz und die Gelelektrophorese vorhergesagten ähnlich ist, obwohl die Länge der Zuckerseitenketten noch unbekannt ist. Darüber hinaus haben wir die Fab-Antikörper-GP-Strukturen mit atomarer Auflösung angepasst, die an jedes der beiden wichtigsten EBOV-GP-neutralisierenden Epitope binden, die zuvor untersucht wurden, nämlich MR78 (3X2D15) und KZ52 (3CSY18): (Abb. 3c). Dies deutet darauf hin, dass die mutmaßliche muzinähnliche Domäne (die wahrscheinlich aus dem Propellerblatt und möglicherweise den hier beschriebenen Noppenmerkmalen besteht) innerhalb der Grenzen der Auflösung, die wir mit unserer 3D-Struktur des Spikes in situ in der Hülle erreicht haben, wahrscheinlich keine dieser Antikörper-Neutralisierungsstellen stört oder steuert, was darauf hindeutet, dass die Neutralisierung vor der Spaltung der muzinähnlichen Domäne im Endosom möglich ist. Es ist klar, dass sich unsere Struktur von den 3-D-EM-Strukturen des heterolog exprimierten Ebola-GP-Spikes unterscheidet, der in situ in der Plasmamembran beobachtet wurde und zuvor von uns und anderen veröffentlicht wurde (Abb. 4). Beide Strukturen enthielten manipuliertes exprimiertes Material mit mutierten oder teilweise sequenzverkürzten Proteinen, die in virusähnlichen Partikeln hergestellt wurden. Die Spike-Struktur von Beniac et al., die innerhalb der virusähnlichen Partikel abgebildet wurde, wurde irgendwie abgeschnitten, da sie die mucinähnlichen Domänen hätte enthalten müssen: Außerdem wurde die Tomographie mit der Analyse einzelner Partikel kombiniert, was die Ergebnisse möglicherweise verzerrt hat4. Die Struktur, über die wir hier berichten, basiert vollständig auf der gut akzeptierten Methode der Einzelpartikelanalyse unter Verwendung von Projection Matching und ähnelt im Großen und Ganzen derjenigen, die für exprimiertes GP in virusähnlichen Partikeln mithilfe der Tomographie veröffentlicht wurde28,29: Es gibt deutliche Unterschiede in Form und Größe des Spikes sowie in der Auflösung (Abb. 4). Die zuvor ermittelten Strukturen von GP mit atomarer Auflösung scheinen gut in die Kryo-EM-Struktur zu passen, über die wir hier berichten (Abb. 2 und 3), und die Auflösung ist, obwohl bescheiden (11 Å), eine Verbesserung im Vergleich zu ~25 Å für die Strukturen, die allein durch Tomographie erzeugt wurden und die eine etwas andere Form zu haben scheinen (Abb. 4). Während unsere Struktur eine Spike-Länge von 13 nm, eine Stiel-Länge von 5 nm und eine Breite von 3,5 nm aufweist, zeigen die tomographischen Strukturen eine Spike-Länge von 14 nm mit einem engeren, kürzeren und schmaleren Stiel-Bereich von 2,5 nm Länge und 3 nm Breite, während die Virion-Hülle an der Basis auch vom GP-Stiel weg geneigt zu sein scheint (Abb. 4). In unserer Struktur sind die 5 nm dicke Doppelschicht der Virionhülle (mit einem inneren Abstand von etwa 35 Å, Abb. 4a) sowie die Alpha-Helices der Heptad-Repeat-Domänen (mit einem Durchmesser von etwa 12 Å) und die Noppenstruktur an der Basis der Propeller deutlich zu erkennen, während diese Merkmale in den früheren Strukturen28,29 nicht erkennbar waren (Abb. 4b). Diese Unstimmigkeiten könnten auf die Unterschiede zwischen dem exprimierten und dem viralen Material zurückzuführen sein, von denen letzteres im vorliegenden Bericht verwendet wurde. Ein Faktor für die verbesserte Auflösung war die Verwendung einer optimal dimensionierten T-förmigen Maske und die Auswahl gerader Bereiche der Virionmembran für die Analyse (ergänzende Abbildung S3). Dies ermöglichte eine genaue Ausrichtung und Auswahl von Bildern, die im rechten Winkel zur dreifachen Achse der Spikes aufgenommen wurden, und gleichzeitig eine hervorragende Abdeckung der Seitenansichten, da die Spikes zufällig auf ihren dreifachen Achsen verteilt sind, wobei Euler-Winkel von 0-120 Grad der Rotation um die Z-Achse (da es sich um ein Trimer handelt) verwendet wurden. Auf diese Weise konnten wir den „fehlenden Informationskeil“ vermeiden, der bei der Tomographie auftritt, wo die Winkelverteilung der Ansichten durch den Neigungswinkel eingeschränkt wird. Unsere Analysen ergaben keine Längssymmetrie oder geordnete Periodizität der GP-Spikes entlang der Achse des Virionfilaments, was zeigt, dass die Spike-Anordnung der Virionen möglicherweise keiner starren Symmetrie folgt. Auch in der VP40-Matrixschicht des Virions war keine Längssymmetrie erkennbar (obwohl in Bildern, die eine senkrechte Ansicht der VLP-Membran zeigen, ein Gitterabstand von 5 nm in der VP40-Schicht beobachtet wurde4). Wir haben gezeigt, dass die GP-Spikes von EBOV-Virionen wahrscheinlich einen inkonsistenten oder variablen Abstand haben, ähnlich dem, der zuvor für EBOV-VLPs gezeigt wurde (ergänzende Abbildung S3). Wir haben auch frühere Ergebnisse4 bestätigt, die zeigen, dass die Nukleokapsidschicht der Virionen trotz der Kurven und Biegungen des Filaments einen gleichmäßigen, geordneten Längsabstand von etwa 7 nm beibehält (ergänzende Abbildung S3). Somit könnten die Kontakte zwischen GP und VP40 und/oder den Nukleokapsidproteinen variabel und nicht äquivalent sein: oder wenn es eine bevorzugte Ausrichtung und Stöchiometrie gibt, war sie mit unseren aktuellen Daten durch Kryo-EM von ganzen Virionen nicht nachweisbar.

Abbildung 2: 3D-Struktur des EBOV-Spikes.

(a) GP-Trimer mit der angedockten GP1-GP2-Struktur 5JQ7 aus verschiedenen Perspektiven dargestellt. Das Farbschema für die 3D-Rekonstruktion ist wie folgt: orange, distales Ende des GP-Spikes; gelb, Körper des GP-Spikes; grün, Stiel des GP-Spikes; und blau, integriert in die Virushülle. Die drei GP1-GP2-Untereinheiten in 5JQ7 sind blau, grün und gelb gefärbt, Toremifen ist rot. (b) Oberflächen- und Banddarstellungen von 5JQ7 zum Vergleich mit (a): Die C-terminalen Enden von GP2 sind durch Pfeile gekennzeichnet. (c) Die in der 13,4 Å gefilterten Tiefpass-Rekonstruktion sichtbaren Transmembrandichten (roter Pfeil, links) stimmen mit den Heptad-Repeat-Alpha-Helices der angedockten GP2-Kernstruktur 2EBO (rechts: rote Punkte) überein.

Abbildung 3: Zusammenführung von Kryo-EM- und atomar aufgelösten 3D-Strukturen.

(a) Die atomar aufgelösten Strukturen 5JQ7 und 5JNX (NPC1-GP, magenta) wurden mit Chimera an das Ebola-GP angedockt (GP-Trimer-Untereinheiten in grün, blau und gelb; NPC1-GP in magenta). Die Kryo-EM-Rekonstruktion ist mit einem Schwellenwert dargestellt, der die Virushülle zeigt, und verwendet denselben Farbcode wie in Abb. 2. (b) Die GP-Spike-Rekonstruktion ist mit einem Schwellenwert dargestellt, der seiner Molekülmasse entspricht, um die gute Anpassung von 5JQ7 zu verdeutlichen. Die Einfügung zeigt die Position von Toremifen (rot), und die Reste der Rezeptor-Bindungsstelle sind rot gefärbt. (c) Die atomar aufgelösten Strukturen der neutralisierenden Antikörper KZ52 Fab (3CSY, beige) und MR78 Fab (3X2D, rosa) wurden mit Chimera an das Ebola-GP angedockt.

Abbildung 4: Vergleich der Ebola-Spike-Strukturen, die an die virale Membran gebunden sind.

Die in dieser Untersuchung vorgestellte, von einem einzelnen Partikel abgeleitete Struktur (a) wird mit einer Struktur verglichen, die mit Hilfe der Subtomogramm-Analyse berechnet wurde (b). Die Cryo-EM-Rekonstruktionen sind mit dem gleichen Farbcode wie in Abb. 2 dargestellt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die aktuelle Struktur mit der mucinartigen Domäne übereinstimmt, die die Glykankappe und die rezeptorbindende Region verschließt, so dass die Spaltung für die Funktion der letzteren im Endosom erforderlich ist, um die Rezeptorbindungsstelle auf GP113,17,20,21,22 freizulegen. Es ist wahrscheinlich, dass die Abspaltung der Glykankappe auch die Entfernung der hier beschriebenen „Propeller“- und „Nub“-Strukturen beinhaltet. Es ist klar, dass die Dichte in unserer Struktur die Rezeptorbindungsdomäne teilweise bedeckt und wahrscheinlich die NPC-1-Bindung hemmt, bis die Spaltung der mucinartigen Domäne erfolgt. Weitere hochauflösende Studien der viralen GP-Struktur und der Virionpartikel sind erforderlich, um diese Fragen zu beantworten und das Wissen über die Morphogenese von EBOV zu erweitern. In zukünftigen Studien werden Analysen der räumlichen Anordnung der Spikes in der Membran, der strukturellen Anordnung der transmembranen und zytoplasmatischen Domänen und die Analyse flexibler, quasi-äquivalenter Verbindungen zwischen dem Hüllmatrixprotein VP40 und dem Nukleokapsid wichtig sein, um unser Verständnis darüber zu erweitern, wie diese viralen Komponenten im Replikationszyklus von EBOV funktionieren.

Schreibe einen Kommentar

Deine E-Mail-Adresse wird nicht veröffentlicht.