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I primi sistemi agricoli, basati sulla coltivazione di cereali, legumi e l’allevamento di bestiame addomesticato si sono sviluppati nel sud-ovest dell’Asia circa 11.000 anni prima di oggi (YBP) (1, 2). Entro il 6.000 YBP, l’agropastoralismo introdotto dalla rivoluzione agricola neolitica divenne il principale sistema di produzione alimentare in tutta l’Europa preistorica, dal nord del Mediterraneo alla Gran Bretagna, Irlanda e Scandinavia (3), a sud nel Nord Africa (4) e ad est nell’Asia occidentale e centrale (5).

Le pecore e le capre furono le prime specie di animali domestici (6). Eventi multipli di addomesticamento, come dedotto da molteplici lignaggi mitocondriali, hanno dato origine alle pecore domestiche e similmente ad altre specie domestiche (7-10). Inizialmente, le pecore erano allevate principalmente per la carne ma, durante il quinto millennio BP nell’Asia sud-occidentale e il quarto millennio BP in Europa, la specializzazione per prodotti “secondari” come la lana divenne evidente. Le pecore selezionate per i prodotti secondari sembrano aver sostituito le popolazioni domestiche più primitive. Non si sa con certezza se la specializzazione per i prodotti secondari sia avvenuta prima nell’Asia sud-occidentale o in tutta Europa, a causa della mancanza di prove archeologiche definitive per l’inizio della produzione della lana (6, 11, 12).

In questo studio abbiamo usato una famiglia di retrovirus endogeni (ERV) come marcatori genetici per studiare la storia della pecora domestica. Gli ERV risultano dall’integrazione stabile del genoma del retrovirus (“provirus”) nella linea germinale dell’ospite (13) e sono trasmessi verticalmente da una generazione all’altra in modo mendeliano. Il genoma della pecora contiene almeno 27 copie di retrovirus endogeni legati al retrovirus esogeno e patogeno della pecora Jaagsiekte (enJSRVs) (14-16). La maggior parte dei loci enJSRVs sono fissi nelle pecore domestiche, ma alcuni sono distribuiti differentemente tra le razze e gli individui (cioè, sono inserzionalmente polimorfici) (14). Gli enJSRV possono essere usati come marcatori genetici altamente informativi perché la presenza di ogni retrovirus endogeno nel genoma dell’ospite è il risultato di un singolo evento di integrazione in un singolo animale ed è irreversibile, quindi le popolazioni che condividono lo stesso provirus nella stessa posizione genomica sono de facto filogeneticamente correlate.

Abbiamo analizzato campioni di DNA genomico raccolti da 1362 animali appartenenti a 133 razze di pecora domestica (Ovis orientalis aries solitamente indicata come Ovis aries) e ai parenti selvatici più prossimi (vedi sotto) suddivisi in 65 gruppi formati da una o più razze che condividono una posizione geografica comune e/o legami di allevamento (Tabella S1) (17). I campioni esaminati comprendevano anche la pecora Urial (Ovis vignei), e il muflone mediterraneo e asiatico (Ovis orientalis musimon, Ovis orientalis ophion e Ovis orientalis orientalis). La stragrande maggioranza delle razze che abbiamo studiato sono locali, storicamente legate a specifiche aree geografiche e non sottoposte ai programmi di allevamento intensivo delle greggi commerciali.

I campioni sono stati testati per la presenza o l’assenza di sei enJSRV polimorfici a inserzione ereditati indipendentemente (enJSRV-18, enJSRV-7, enJSRV-8, enJSRV-15, enJSRV-16, e enJS5F16) mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) utilizzando due serie di primer che amplificano rispettivamente le ripetizioni 5′ e 3′ del terminale lungo (LTR) di ciascun provirus (comprese le sequenze di DNA genomico dell’ospite) come precedentemente descritto (14, 17). Provirus enJSRV-18 aveva di gran lunga la più alta frequenza nel nostro set di dati (85%), enJSRV-7 e enJS5F16 sono stati rilevati nel 27% e 30% dei campioni, rispettivamente, mentre enJSRV-15, enJSRV-16 e enJSRV-8 erano presenti solo nel 3-5% dei campioni (Fig. 1A).

Distribuzione mondiale di enJSRV inserzionalmente polimorfici. Distribuzione dei loci enJSRV inserzionalmente polimorfici analizzati in questo studio in 65 popolazioni di pecore che rappresentano razze locali del vecchio mondo. (A) Le frequenze di ogni locus enJSRV in ogni popolazione sono rappresentate da una barra verticale e disposte in ordine decrescente. Le frequenze di inserzione sono state ottenute utilizzando il software Arlequin 3.11 (27) trattando l’assenza di uno specifico provirus enJSRV come un allele recessivo. (B) Località delle popolazioni di pecore campionate. (C-F). Mappe di interpolazione che mostrano la distribuzione spaziale delle frequenze stimate di enJSRVs. La variazione geografica è stata visualizzata utilizzando la “Spatial Analyst Extension” del software ArcView GIS 3.2 (ESRI, Redlands, CA, USA; http://www.esri.com). I valori delle mappe interpolate sono stati calcolati utilizzando la ponderazione a distanza inversa con 12 vicini più vicini e una potenza di due, e le superfici di interpolazione sono state divise in 13 classi con frequenze di inserzione più alte indicate dall’ombreggiatura più scura. Il punto centrale dell’area di campionamento è stato usato come coordinate geografiche per ogni popolazione (Tabella S1).

Abbiamo dedotto la distribuzione dei loci enJSRV inserzionalmente polimorfici nelle prime pecore addomesticate determinando la loro presenza nella pecora Urial e nel muflone mediterraneo/asiatico, e poi verificando le firme molecolari indicative dell’età di un provirus. La divergenza stimata tra l’Urial (uno dei parenti viventi più vicini alla pecora domestica) e la pecora domestica è di circa 800.000 YBP (18). Di conseguenza, qualsiasi provirus condiviso tra queste due specie sarà precedente al processo di domesticazione. Lo stesso vale per il muflone asiatico che si ritiene essere l’antenato diretto della pecora domestica (19-21), mentre il muflone mediterraneo, strettamente correlato, si pensa sia il residuo della prima pecora addomesticata riadattata alla vita selvatica (19, 22, 23). Nonostante la sua ampia distribuzione nei campioni esaminati, enJSRV-18 era assente dalla pecora Urial (n=5), dal muflone mediterraneo (n=17) e dal muflone asiatico (n=15). Al contrario, il relativamente più raro enJSRV-7 è stato rilevato in tre delle cinque pecore Urial, nella maggior parte (86%) dei mufloni asiatici e in tutti i mufloni mediterranei. Questi dati suggeriscono che l’integrazione di enJSRV-7 nella linea germinale dell’ospite precede l’integrazione di enJSRV-18. Le differenze tra il prossimale (5′) e distale (3′) lunghe ripetizioni terminali (LTR) di enJSRV-7 confermano la sua antecedenza. La divergenza tra la 5′ e la 3′ LTR di un retrovirus endogeno fornisce una stima dell'”età” di un provirus endogeno perché, dopo l’infezione, i retrovirus trascrivono inversamente il loro genoma da RNA in DNA e durante questo processo duplicano le estremità genomiche dando origine a due LTR identiche. Le LTR prossimali e distali di un retrovirus endogeno devono essere identiche al momento dell’integrazione, ma possono divergere nel tempo alla stessa velocità delle sequenze non codificanti (~ 2,3-5 × 10-9 sostituzioni per sito all’anno). enJSRV-7 sembra essere il più antico provirus nei nostri campioni dal momento che mostra cinque sostituzioni nucleotidiche tra 5′ e 3′ LTR (445nt lungo), mentre tutti gli altri provirus inserzionalmente polimorfici (tra cui enJSRV-18) possiedono LTR identici. Questi dati suggeriscono che le popolazioni originarie delle prime pecore addomesticate non portavano nessuno degli enJSRV inserzionalmente polimorfici usati in questo studio o portavano enJSRV-7.

La variazione geografica di tutti i loci enJSRV è stata visualizzata costruendo mappe di interpolazione dai loro valori di frequenza di inserzione (Fig. 1B-F). La più alta frequenza di enJSRV-7 è stata trovata nel muflone mediterraneo e nelle pecore Soay che ora abitano l’isola di St. Kilda al largo della Scozia nord-occidentale (Fig. 1C). enJSRV-18 era uniformemente distribuito a frequenze molto alte in tutto il Vecchio Mondo. Basse frequenze di enJSRV-18 sono state osservate nelle isole abitate dal muflone mediterraneo e nelle regioni periferiche dell’Europa occidentale. Due provirus enJSRV, enJS5F16 e enJSRV-8, hanno mostrato un modello geografico simile con un’alta frequenza nelle isole britanniche e in Scandinavia (Fig. 1E e F). I meno comuni enJSRV-15 e enJSRV-16 hanno avuto modelli geografici meno evidenti (Fig. S1).

Abbiamo poi analizzato la combinazione di enJSRV polimorfici per inserzione (che chiamiamo ‘retrotipo’) in ciascuna delle popolazioni analizzate (Fig. 2). Il retrotipo R2 (che rappresenta solo la presenza di enJSRV-18) era il retrotipo predominante nella maggior parte delle popolazioni analizzate. È interessante notare che il retrotipo R4, che indica la presenza di enJSRV-18 e enJSRV-7 insieme (Fig. 2), era un altro retrotipo comune nella zona corrispondente alla Fenicia storica e nell’Europa meridionale, suggerendo che il commercio marittimo e la colonizzazione hanno avuto una grande influenza sul movimento delle pecore nel Mediterraneo, confermato da studi che utilizzano la variazione del DNA mitocondriale delle pecore (24, 25). Ulteriori inserzioni enJSRV hanno rappresentato i retrotipi più complessi delle popolazioni del Nord Europa (vedi anche il testo online di supporto). Le popolazioni di pecore in Africa, Pakistan e Cina hanno mostrato un modello omogeneo di retrotipo R2 comune alle popolazioni dell’Asia sud-occidentale, suggerendo collegamenti migratori diretti di pecore domestiche tra queste aree. La maggior parte delle popolazioni della Scandinavia ha mostrato retrotipi simili a quelli delle popolazioni islandesi e delle isole Fær Øer, sostenendo i movimenti storicamente registrati dei coloni nordici durante il primo millennio dopo Cristo (26). Per visualizzare la relazione genetica delle popolazioni testate abbiamo analizzato i dati utilizzando due approcci diversi: un grafico di scala multidimensionale (MDS) ottenuto dalla matrice interpopolazione delle distanze genetiche imparziali di Nei e l’analisi delle componenti principali (PCA) calcolata dalla matrice di correlazione tra le frequenze di inserzione di enJSRV.

Combinazione di provirus enJSRV (retrotipi) nella pecora domestica. I grafici a torta nella figura rappresentano la frequenza di ogni retrotipo nelle 65 popolazioni testate. Ad ogni pecora testata è stato assegnato un retrotipo sulla base della combinazione di provirus enJSRV polimorfici da inserzione presenti nel loro genoma. I retrotipi sono stati definiti da R0 a R14 come segue: RO = nessun enJSRV inserzionalmente polimorfo; R1 = enJSRV-7; R2 = enJSRV-18; R3 = enJS5F16; R4 = enJSRV-7 + enJSRV-18; R5 = enJSRV-7 + enJS5F16; R6 = enJSRV-18 + enJS5F16; R7 = enJSRV-7 + enJSRV-18+ enJS5F16; R8 = enJSRV-8; R9 = enJS5F16 + enJSRV-8; R10 = enJSRV-7 + enJS5F16 + enJSRV-8; R11 = enJSRV-18 + enJSRV-8; R12 = enJSRV-18 + enJS5F16 + enJSRV-8; R13 = enJSRV-7 + enJSRV-18 + enJSRV-8; R14 = enJSRV-7 + enJSRV-18 + enJS5F16 + enJSRV-8. Ogni retrotipo è rappresentato con un colore diverso (e modello) come indicato nella figura. I numeri accanto a ogni grafico a torta indicano ciascuna delle 65 popolazioni testate come indicato nella tabella S1. Si noti che la maggior parte delle popolazioni dell’Asia sud-occidentale, dell’Asia centrale, dell’Europa meridionale e dell’Africa possiede R2 (cioè la presenza del solo enJSRV-18, indicato in verde) come retrotipo predominante. Intorno al bacino del Mediterraneo c’è anche un’alta percentuale di R4 data dalla presenza contemporanea di enJSRV-7 e enJSRV-18 (mostrato in giallo). Le razze primitive sono caratterizzate da un’alta proporzione di animali con R0 (nessun provirus inserzionalmente polimorfo, mostrato in bianco) o R1 (presenza del solo enJSRV-7, mostrato in rosso). Un retrotipo “nordico” R3 (mostrato in blu) era caratterizzato da una bassa frequenza di enJSRV-18 e un’alta frequenza di enJS5F16; le popolazioni nordiche avevano anche una frequenza relativamente alta di pecore con nessuno dei provirus inserzionalmente polimorfici testati.

L’analisi MDS ha rivelato una marcata separazione (particolarmente evidente nella prima dimensione) tra la grande maggioranza delle razze domestiche e un gruppo esterno formato dalle razze Mouflon, Soay sheep, Hebrideans, Orkney sheep, Icelandic e Nordic (Figura 3A). Risultati simili sono stati ottenuti con la PCA (Figura 3B). Collettivamente, i dati ottenuti indicano che i relitti delle prime migrazioni sono ancora presenti nei mufloni della Sardegna, della Corsica e di Cipro e nelle razze delle zone periferiche del Nord Europa. Sulla base dei loro retrotipi, queste popolazioni primitive sono caratterizzate dall’assenza di enJSRV-18 (fissato nella maggior parte delle razze moderne) e dalla presenza di enJSRV-7 in alta frequenza o dalla mancanza di enJSRV inserzionalmente polimorfici (incluso enJSRV-7). Al contrario, i retrotipi della grande maggioranza delle razze ovine si raggruppano e sono caratterizzati dall’alta frequenza o dalla fissazione di enJSRV-18.

Distanze genetiche tra le popolazioni ovine sulla base delle frequenze di inserzione di enJSRVs. (A) Grafico di scala multidimensionale (MDS) calcolato dalla matrice delle distanze genetiche imparziali di Nei (software TFPGA 1.3) (28). La natura dominante degli enJSRV come marcatori genetici è stata considerata in tutte le analisi. La matrice delle distanze interpopolazione è stata riassunta in due dimensioni utilizzando l’analisi MDS implementata dal pacchetto software STATISTICA ’99 (StatSoft Inc., Tulsa, OK, USA). Ogni triangolo rappresenta una delle 65 popolazioni testate. Si noti che nel grafico sono state nominate solo le popolazioni al di fuori del cluster principale (racchiuso all’interno del quadrato con la linea spezzata e comprendente la grande maggioranza delle razze provenienti da Africa, Asia ed Europa). (B) Trama tridimensionale che riassume i dati ottenuti dall’analisi delle componenti principali (PCA) dei provirus enJSRV polimorfi da inserzione nelle 65 popolazioni ovine analizzate utilizzando il Proc Factor del pacchetto statistico SAS/STAT® (SAS Institute Inc, Cary NC) secondo le raccomandazioni di Cavalli-Sforza et al. (29). Sono stati identificati quattro fattori, che rappresentano l’86,66% della variazione, con autovalore ≥ 1. Il fattore 1 (sull’asse delle X), ha spiegato il 30,09% della variazione e può essere interpretato come il “fattore Mare del Nord”, distinguendo tra un gruppo di popolazioni formate da alcune popolazioni di pecore del Regno Unito e dell’Europa continentale (comprese Danimarca e Texel) e le altre. Fattore 2 (sull’asse Y), che spiega il 23,58% della variazione separando la popolazione di Texel dal resto. Fattore 3 (sull’asse Z), spiega il 22,92% della variazione e può essere interpretato come il “fattore razza primitiva”, distinguendo il gruppo di popolazioni formato dalle popolazioni muflone e scandinave (comprese le popolazioni Hebridean, Orkney e Soay) dal resto. Si noti che per aumentare la chiarezza della figura, le popolazioni che formano il cluster principale non sono state nominate.

I retrotipi omogenei (R2, R2-R4) che abbiamo osservato nelle pecore dell’odierna Turchia, Iran, Arabia Saudita, Siria, Israele ed Egitto, combinati con le prove archeologiche disponibili, suggeriscono che la selezione delle pecore domestiche con le caratteristiche secondarie desiderate comuni alle razze moderne è avvenuta prima nell’Asia sud-occidentale e poi si è diffusa con successo in Europa e Africa e nel resto dell’Asia. Questo può fornire un supporto genetico alla teoria che la produzione di lana specializzata sia nata nell’Asia sud-occidentale e si sia poi diffusa in Europa (11). Le razze primitive sono sopravvissute alle seconde migrazioni di razze migliorate dall’Asia sud-occidentale ritornando ad uno stato ferale o semi-ferale in isole senza predatori o occupando aree inaccessibili meno soggette a scambi commerciali e all’introgressione associata. La maggior parte, se non tutte, le razze che abbiamo identificato come di origine antica erano già considerate primitive sulla base di tratti morfologici come un pelo più scuro e grossolano (invece di un vello lanoso più bianco), una muta e la frequente presenza di corna sia nelle femmine che nei maschi (Fig. 4).

Caratteristiche morfologiche delle razze primitive. Le razze identificate in questo studio come resti delle prime migrazioni di pecore possiedono caratteristiche morfologiche (come il vello più scuro e grossolano, il mantello da muta, la frequente presenza di corna nelle femmine), simili alle pecore selvatiche e al muflone. (A) Pecora Urial; (B) Muflone di Cipro; (C) Muflone mediterraneo; (D) Pecora delle Orcadi; (E) Pecora Soay; (F) Pecora Gute; (G) Pecora Åland; (H) Pecora islandese; (I) Pecora Hebridea.

Il nostro studio fornisce anche prove genetiche a sostegno dell’origine aneddotica di alcune razze ovine meno comuni. Per esempio, una delle 10 popolazioni analizzate delle isole britanniche, la pecora Jacob, ha mostrato un retrotipo R2 omogeneo molto diverso dalle altre popolazioni britanniche e più simile alle razze asiatiche e africane del sud-ovest. Le origini della Jacob sono sconosciute. Questa razza deve il suo nome alla storia biblica di Giacobbe che prese “ogni pecora maculata e pezzata” come salario da suo suocero Labano (Genesi 30:25-43; probabilmente il primo uso registrato dell’allevamento selettivo nel bestiame). La nostra analisi retrotipica supporta un collegamento diretto tra la pecora Jacob e le razze del sud-ovest dell’Asia o dell’Africa piuttosto che altre razze britanniche. Il nostro studio collega anche saldamente la pecora Soay con il muflone mediterraneo e asiatico piuttosto che con le razze nordiche.

In conclusione, la natura polimorfica degli enJSRV ha rivelato una notevole espansione secondaria della popolazione di pecore domestiche migliorate, molto probabilmente fuori dall’Asia sud-occidentale, fornendo preziose informazioni sulla storia delle società pastorali la cui economia includeva l’allevamento delle pecore. Differenziando per la prima volta le razze geneticamente primitive da quelle moderne, il nostro studio offre una logica per identificare e preservare i pool di geni rari. Infine, dimostriamo l’utilità dei retrovirus endogeni come una nuova classe di marcatori genetici utilizzati per svelare la storia di una specie addomesticata.

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