Structure of the Ebola virus glycoprotein spike within the virion envelope at 11 Å resolution

Aby ustalić bardziej definitywną strukturę natywnego kolca w obrębie cząsteczki EBOV, przeanalizowaliśmy oczyszczone bona-fide EBOV w celu zobrazowania kolca GP w obrębie otoczki wirionu (Rys. 1a,c). Te obrazy kolców GP były analizowane wyłącznie metodą pojedynczych cząstek (Rys. S1,S2), jako porównanie do struktur uzyskanych wcześniej przez nas i innych przy użyciu metod tomograficznych. Zaobserwowano rozbieżności między strukturami całego, nieobciętego EBOV GP wyznaczonymi przy użyciu materiału wyprodukowanego przy użyciu różnych heterologicznych systemów ekspresji oraz między strukturami uzyskanymi przy użyciu alternatywnych tomograficznych lub jednocząsteczkowych metod przetwarzania obrazów trójwymiarowych 4,28. Ze względów bezpieczeństwa preparat wirusa poddano działaniu sieciowania paraformaldehydem (po odwirowaniu) w protokole, który, jak wcześniej wykazano, zachowuje struktury białkowe i lipidowe4,30. Wirusy Ebola są elastyczne, a włókna wirusowe są często zakrzywione, gdy są przygotowywane w stanie zamrożonym i uwodnionym do mikroskopii krioelektronowej (Rys. 1b). Dlatego do przetwarzania obrazu wybrano regiony wirusów, które były tak proste, jak to tylko możliwe (Ryc. 1c). Nasze dane zawierały 32,960 pojedynczych obrazów spike do analizy pojedynczych cząstek. Ponadto, 29 976 obrazów wybrano do analizy bez odniesienia do połowy średnicy EBOV, aby zbadać rozkład przestrzenny kolców GP, a także okresowość i symetryczne relacje między GP i białkiem macierzy VP40 w otoczce, a także leżącą pod spodem warstwą nukleokapsydu (ryc. 1c i S3).

Rysunek 1

Mikroskopia elektronowa (a) Negatywnie wybarwionego EBOV, (wstawka pokazująca wirusa w większym powiększeniu). Zastosowano rozogniskowanie 2-3 mikronów, dzięki czemu kolce są widoczne w niskim kontraście. Żółte strzałki wskazują na poszczególne kolce GP. (b) Cryo-EM EBOV, czarne „kropki” to 10 nm złoto koloidalne dodane w celu ogniskowania. (c) Większe powiększenie ukazujące pojedyncze kolce GP (żółte kółka), otoczka wirusowa jest oznaczona białymi nawiasami. Czerwony kwadrat pokazuje względny rozmiar obrazów półśrednich używanych do symetrycznej analizy przetwarzania obrazu pokazanej w Supplementary Fig. S3. Biały kwadrat pokazuje względny rozmiar obrazów, które zostały użyte do danych przetwarzania obrazu w pokazanych Fig. 2 i Supplementary Fig. S2.

Strukturę 3-D dla trimeru kolców GP in situ, wewnątrz otoczki wirusowej, z rozdzielczością 11 Å, obliczono (Fig. 2 i 3, Supplementary Fig. S4) przy użyciu procedury dopasowywania projekcji na zamaskowanych obrazach31,32. Byliśmy w stanie zadokować strukturę atomową EBOV GP (5JQ7) zawierającą domeny GP1 i GP2 o pełnej długości, ale z obciętymi domenami mucynopodobnymi (Rys. 2b). To wyraźnie pokazuje szereg cech kolca pochodzącego z wirusa, w tym strukturę i rozmieszczenie domen mucynopodobnych w odniesieniu do struktury GP1-GP2. W szczególności, podstawa kolca, składająca się z domen fuzyjnych GP2 z motywami powtórzenia heptad, pasuje wyjątkowo dobrze: struktura 5JQ7 o rozdzielczości atomowej wypełnia objętość naszej trójwymiarowej struktury cryo-EM (Rys. 2a). Bliskość dopasowania, szczególnie w obszarze łodygi lub „szyjki” trimeru GP, jest widoczna, gdy struktura kolca jest wyświetlana w gęstości, w której wyraźnie widać 5 nm grubości warstwę dwuwarstwową otoczki wirionu (Rys. 2a,c i 3a), a także gdy powierzchnia jest obcięta do poziomu, w którym objętość jest zbliżona do masy cząsteczkowej 310 kDa (Rys. 2 i 3b). Alfa-heliksy GP2 widoczne są u podstawy kolca (Rys. 2a), a gdy rekonstrukcja wyświetlana jest na nieco wyższym poziomie konturu, widoczne są zagęszczenia przecinające wnętrze błony (Rys. 2c). Ponieważ N-końcowe końce zadokowanych domen alfa-5 GP2 (2EBO24) wydają się pokrywać z tymi zagęszczeniami transmembranowymi, te ostatnie mogą być wskazówką dla putatywnych hydrofobowych alfa-helikalnych regionów transmembranowych GP2 (Rys. 2c). Wykorzystując przewidywaną masę GP (zmierzoną przez elektroforezę żelową GP pochodzącego z wirionu33) dostosowaliśmy objętość struktury 3-D na Rys. 2, stosując wartość 0,8 Da/Å3 jako przybliżoną gęstość dla białka34. Ponieważ struktura 5JQ7 ma 163 kDa35, obcięte domeny mucynopodobne i transmembranowe, w tym glikany, reprezentują ~150-170 kDa, w przybliżeniu połowę masy kolca. Patrząc z góry, kłos GP wygląda jak trójłopatowe śmigło (ryc. 2a i 3b). Długość trzech „łopatek” obejmuje okrąg o średnicy 18 nm. Patrząc z boku, kłos GP ma region łodygi przylegający do otoczki wirusowej, która następnie rozprzestrzenia się do górnej części kłosa GP. Zidentyfikowana w 5JQ7 „kieszeń” lub „tunel” wiążący toremifen znajduje się blisko powierzchni trójwymiarowej struktury EM, z boku łodygi u podstawy śmigieł (Rys. 2a i 3b). U podstawy łodygi na Rys. 2a, trzy powtórzone heliksy heptad u podstawy GP2 pasują dokładnie do trzech pasm widocznych w naszej strukturze EM 3-D, które wydają się penetrować błonę wirionu (Rys. 2a i 3a). Ponadto, patrząc od góry, każde ostrze ma mniejszy wypust bliżej osi 3-fold, który wystaje dystalnie (Rys. 2a i 3b). Używając poziomu konturu 332 kDa, te wypustki ściśle odpowiadają miejscu wiązania receptora, obejmując większość reszt, o których wiadomo, że są zaangażowane w wiązanie, jak również wystają w sąsiedztwie regionów czapeczki glikanu. Każda łopatka śmigła, o której wiadomo, że zawiera domenę mucynopodobną28, całkowicie pokrywa miejsce, o którym wiadomo, że wiąże się z receptorem NPC-1 (Rys. 3b). Tak więc około połowa masy w naszej strukturze, poza otoczką, to domeny mucynopodobne. Kiedy mapa gęstości jest konturowana do poziomu, który usuwa warstwę lipidową z obrazu, łodyga nadal ściśle przylega do powierzchni struktury o rozdzielczości atomowej, podczas gdy tam dystalne końce ostrzy i „węzły” czapeczki glikanowej są nieco obcięte. Wskazuje to, że te regiony struktury mają prawdopodobnie mniejszą gęstość, co jest zgodne z tym, że są one wysoce glikozylowane, jak przewiduje sekwencja aminokwasowa domeny mucynopodobnej.Zadokowaliśmy również strukturę 5JNX36, która zawiera część rozszczepionej glikoproteiny (GPcl) w kompleksie z pełnometrażową ludzką NPC1, i nałożyliśmy strukturę rozdzielczości atomowej na jeden monomer przy użyciu modułu programu „Fit in Map” w UCSF Chimera (Rys. 3a). Wskazuje to, że domena mucynopodobna (cała niezajęta gęstość pozostała w strukturze 3-D EM po dopasowaniu GP1-GP2) całkowicie przykrywa czapeczkę glikanową, a czop z boku śmigła przykrywa większość, jeśli nie całość, miejsca wiązania receptora (Rys. 3a), wskazując, że usunięcie lub rozszczepienie domeny mucynopodobnej (prawdopodobnie łącznie z czopem), jak również czapeczki glikanowej, może być warunkiem wstępnym do uzyskania wiązania receptora. Zadokowana struktura 5JNX zawiera również region transmembranowy NPC1, dlatego wyrównaliśmy przybliżoną płaszczyznę błony plazmatycznej, gdy kolec GP dokuje z receptorem NPC1, pokazaną na Rys. 3a przezroczystym niebieskim kolorem. Przy braku jakiegokolwiek wygięcia błony endosomalnej w celu dostosowania się do konturu trimeru GP i kompleksu NPC1, płaszczyzna błony plazmatycznej tworzyłaby kąt około 18 stopni w stosunku do błony wirusowej, gdy kolec jest prostopadły do otoczki wirusowej (Rys. 3a). Jest to zgodne z sugestią Gonga i wsp.36, że być może tylko jedno miejsce wiążące receptor NPC1 z trzech na każdym trimerze może być zajęte jednocześnie, a wiązanie z więcej niż jednym receptorem może być wykluczone z powodu interferencji stearynowej. Na Rys. 3a i b pokazano możliw± linię rozszczepienia oddzielaj±c± domenę mucynopodobn± i czapeczkę glikanow± od reszty trimeru. Nasza struktura sugeruje, że domena mucynopodobna i czapeczka glikanowa mogą być rozszczepiane w tym samym czasie, ponieważ ta ostatnia znajduje się całkowicie w obrębie gęstości domeny mucynopodobnej i jest zgodna z masą cząsteczkową domeny mucynopodobnej wynoszącą około 50 kDa, która jest podobna do przewidywanej przez sekwencję oraz elektroforezę żelową, chociaż długość łańcuchów bocznych cukrów jest nadal nieznana. Ponadto, dopasowaliśmy struktury Fab przeciwciała-GP o rozdzielczości atomowej, które wiążą się z każdym z dwóch głównych epitopów neutralizujących EBOV GP, które zostały wcześniej zbadane, MR78 (3X2D15) i KZ52 (3CSY18): (Rys. 3c). Wskazuje to, że w ramach ograniczeń rozdzielczości osiągniętej w naszej strukturze 3-D kolca in situ w otoczce, przypuszczalna domena mucynopodobna (prawdopodobnie składająca się z łopatki śmigła i ewentualnie opisanych tu cech nub) prawdopodobnie nie koliduje ani nie utrudnia stearynowo żadnego z tych miejsc neutralizacji przeciwciał, co jest zgodne z tym, że neutralizacja jest możliwa przed rozszczepieniem domeny mucynopodobnej w endosomie. Jest oczywiste, że nasza struktura różni się od struktur 3-D EM heterologicznie wyekspresjonowanego kolca GP Ebola obserwowanego in situ w błonie plazmatycznej, wcześniej opublikowanych przez nas i innych (ryc. 4). Obie te struktury zawierały zmodyfikowany materiał ekspresyjny wykorzystujący zmutowane lub częściowo sekwencyjnie obcięte białka wytworzone w cząsteczkach wirusopodobnych. Struktura spike Beniac i wsp. obrazowana w obrębie cząstek wirusopodobnych została w jakiś sposób przycięta, ponieważ powinna obejmować domeny mucynopodobne: ponadto tomografia była połączona z analizą pojedynczych cząstek, co mogło zniekształcić wyniki4. Struktura, którą opisujemy tutaj, jest całkowicie oparta na dobrze przyjętej metodzie analizy pojedynczych cząstek przy użyciu dopasowania projekcji i jest zasadniczo podobna do tej opublikowanej dla wyrażonej GP w cząstkach wirusopodobnych przy użyciu tomografii28,29: istnieją zauważalne różnice w kształcie i wielkości kolca, jak również w rozdzielczości (Rys. 4). Wcześniej określone struktury GP o rozdzielczości atomowej wydają się dobrze pasować do struktury krio-EM, o której informujemy tutaj (Fig. 2 i 3), a rozdzielczość, chociaż skromna (11 Å), jest poprawą w porównaniu z ~ 25 Å dla struktur wygenerowanych tylko z tomografii, które wydają się mieć nieco inny kształt (Fig. 4). Podczas gdy nasza struktura pokazuje długość kolca 13 nm oraz długość łodygi 5 nm i szerokość 3,5 nm, struktury tomograficzne pokazują długość kolca 14 nm, z bardziej ściśniętym, krótszym i węższym regionem łodygi o długości 2,5 nm i szerokości 3 nm, podczas gdy otoczka wirionu u podstawy również wydaje się być nachylona od łodygi GP (Rys. 4). Nasza struktura wyraźnie odgranicza 5 nm warstwę dwuwarstwową otoczki wirionu (która ma wewnętrzny odstęp około 35 Å, Rys. 4a), jak również heliksy alfa domen powtórzenia heptad (które mają średnicę około 12 Å) i cechę nub u podstawy śmigieł, podczas gdy te cechy nie były dostrzegalne w poprzednich strukturach28,29 (Rys. 4b). Te niezgodności mogą wynikać z różnic pomiędzy materiałem wyrażonym i wirusowym, z których ten ostatni został użyty w niniejszym opracowaniu. Istotne mogą być również różnice w stosowanych metodach, a czynnikiem wpływającym na poprawę rozdzielczości było zastosowanie optymalnie dobranej wielkości maski w kształcie litery T oraz wybór prostych regionów błony wirionu do analizy (Supplementary Figure S3). Pozwoliło to na dokładne wyrównanie i wybór obrazów wykonanych pod kątem prostym do potrójnej osi kolców, przy jednoczesnym uzyskaniu doskonałego pokrycia widoków bocznych, ponieważ kolce są losowo rozmieszczone na swoich potrójnych osiach, wykorzystując kąty Eulera od 0 do 120 stopni obrotu wokół osi Z (ponieważ jest to trimer). W ten sposób uniknęliśmy „brakującego klina” informacji związanego z tomografią, gdzie ograniczenie kąta nachylenia ogranicza kątowy rozkład widoków. Nasze analizy nie ujawniły żadnej symetrii podłużnej ani uporządkowanej periodyczności kolców GP wzdłuż osi filamentu wirionu, pokazując, że ułożenie kolców w wirionach może nie odpowiadać sztywnej symetrii. Żadna podłużna symetria nie była również widoczna w warstwie matrycy VP40 wirionu (chociaż 5 nm odstępy między siatkami w warstwie VP40 zostały zaobserwowane na obrazach pokazujących prostopadły widok błony VLP4). Wykazaliśmy, że kolce GP wirionów EBOV prawdopodobnie mają niespójne lub zmienne odstępy, podobne do tych, które wcześniej wykazano dla EBOV VLPs (Supplementary Fig S3). Potwierdziliśmy również wcześniejsze wyniki4 pokazujące, że warstwa nukleokapsydowa wirionów utrzymuje stały uporządkowany odstęp wzdłużny około 7 nm (Supplementary Fig S3), pomimo krzywizn i zagięć filamentu. Tak więc wszelkie kontakty między GP i VP40 i/lub białkami nukleokapsydu mogą być zmienne i nieekwiwalentne: lub jeśli istnieje preferowane ułożenie i stechiometria, nie było to wykrywalne przez krio-EM całych wirionów z naszymi obecnymi danymi.

Rysunek 2: Struktura 3D kolca EBOV.

(a) Trimer GP z zadokowaną strukturą GP1-GP2 5JQ7 pokazaną z różnych perspektyw. Schemat kolorów dla rekonstrukcji 3D jest następujący: pomarańczowy – dystalny koniec kolca GP; żółty – ciało kolca GP; zielony – szypułka kolca GP; niebieski – zintegrowany z otoczką wirusową. Trzy podjednostki GP1-GP2 w 5JQ7 są zabarwione na niebiesko, zielono i żółto, a toremifen na czerwono. (b) Widoki powierzchni i wstęgi 5JQ7 dla porównania z (a): C-terminalne końce GP2 są zaznaczone strzałkami. (c) Gęstości transbłonowe widoczne w rekonstrukcji z filtrem dolnoprzepustowym 13,4 Å (czerwona strzałka, po lewej) pokrywają się z heptadowymi powtórzeniami alfa-helikali zadokowanej struktury rdzenia GP2 2EBO (po prawej: czerwone kropki).

Rysunek 3: Łączenie struktur 3D z krio-EM i rozdzielczości atomowej.

(a) Struktury atomowej rozdzielczości 5JQ7 i 5JNX (NPC1-GP, magenta) zostały zadokowane wewnątrz GP Ebola przy użyciu programu Chimera (podjednostki trimeru GP pokolorowane na zielono, niebiesko i żółto; NPC1-GP w kolorze magenta). Rekonstrukcja krio-EM jest przedstawiona z progiem, aby uwidocznić otoczkę wirusa i przy użyciu tego samego kodu kolorystycznego jak na Rys. 2. (b) Rekonstrukcja spajka GP jest przedstawiona przy progu odpowiadającym jego masie cząsteczkowej, aby zilustrować ścisłe dopasowanie 5JQ7. Wstawka pokazuje lokalizację toremifenu (kolor czerwony), a reszty miejsca wiążącego receptor są pokolorowane na czerwono. (c) Struktury o rozdzielczości atomowej przeciwciał neutralizujących KZ52 Fab (3CSY, beżowy), MR78 Fab, (3X2D, różowy) zostały zadokowane w GP Ebola przy użyciu programu Chimera.

Ryc. 4: Porównanie struktur kolców Ebola związanych z błoną wirusową.

Struktura pochodząca z pojedynczej cząsteczki przedstawiona w tym badaniu (a) jest porównana ze strukturą obliczoną przy użyciu analizy sub-tomogramów (b). Rekonstrukcje krio-EM są przedstawione przy użyciu tego samego kodu kolorystycznego, co na Rys. 2.

W podsumowaniu, obecna struktura jest zgodna z domeną mucynopodobną okrywającą czapkę glikanu i region wiążący receptor, tak że rozszczepienie jest wymagane do funkcjonowania tego ostatniego w endosomie, aby odsłonić miejsce wiązania receptora na GP113,17,20,21,22. Jest prawdopodobne, że rozszczepienie czapki glikanowej obejmuje również usunięcie obu opisanych tu struktur „śmigła” i „nub”. Jest jasne, że gęstość w naszej strukturze częściowo pokrywa domenę wiążącą receptor i prawdopodobnie hamowałaby wiązanie NPC-1 do czasu rozszczepienia domeny mucynopodobnej. Dalsze badania o wysokiej rozdzielczości struktury GP wirusa i cząstek wirionów są niezbędne do odpowiedzi na te pytania, a także do poszerzenia wiedzy na temat morfogenezy EBOV. W przyszłych badaniach, analiza przestrzennego rozmieszczenia kolców w błonie, strukturalnego rozmieszczenia domen transmembranowych i cytoplazmatycznych oraz analiza elastycznych, quasi-równoległych połączeń pomiędzy białkiem macierzy otoczki VP40 i nukleokapsydem, będą ważne dla dalszego zrozumienia, jak te wirusowe komponenty funkcjonują w cyklu replikacyjnym EBOV.

.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.