Structura vârfului glicoproteic al virusului Ebola în interiorul învelișului virionului la o rezoluție de 11 Å

Pentru a stabili o structură mai definitivă a vârfului nativ în interiorul particulei EBOV, am analizat EBOV de bună credință purificat pentru a obține o imagine a vârfului GP în interiorul învelișului virionului (Fig. 1a,c). Aceste imagini ale vârfului GP au fost analizate folosind doar metoda particulei unice (Fig. S1,S2), ca o comparație cu structurile obținute anterior de noi și de alții folosind metode tomografice. Au fost observate neconcordanțe între structurile întregii GP netrunchiate a EBOV determinate folosind material produs cu diferite sisteme de expresie heterologă și între structurile obținute folosind metode alternative tomografice sau de procesare a imaginilor tridimensionale cu o singură particulă 4,28. Din motive de siguranță, preparatul de virus a fost tratat prin reticulare cu paraformaldehidă (după centrifugare) în cadrul unui protocol care s-a dovedit anterior că păstrează structurile proteice și lipidice4,30. Virionii Ebola sunt flexibili, iar filamentele virale sunt frecvent curbate atunci când sunt pregătite în stare congelată-hidrat pentru microscopia crioelectronică (Fig. 1b). Prin urmare, regiunile de virioni care au fost cât mai drepte posibil au fost selectate pentru prelucrarea imaginilor (Fig. 1c). Datele noastre au inclus 32.960 de imagini cu vârfuri individuale pentru analiza particulelor individuale. În plus, 29.976 de imagini au fost selectate pentru analiza fără referințe a semidiametrului EBOV pentru a investiga distribuția spațială a vârfurilor GP, precum și periodicitatea și relațiile simetrice dintre GP și proteina matricei VP40 din înveliș, precum și stratul nucleocapsidic subiacent (Figurile 1c și S3).

Figura 1

Microscopie electronică a (a) EBOV cu colorare negativă, (inserția arată virusul la o mărire mai mare). S-a folosit o defocalizare de 2-3 microni, astfel că vârfurile sunt vizibile în contrast redus. Săgețile galbene indică vârfurile GP individuale. (b) Crio-EM a EBOV, „punctele” negre sunt aur coloidal de 10 nm adăugat pentru focalizare. (c) O mărire mai mare care arată vârfurile GP individuale (cercuri galbene), învelișul viral este indicat prin paranteze albe. Pătratul roșu arată dimensiunea relativă a imaginilor cu jumătate de diametru utilizate pentru analiza simetrică de prelucrare a imaginilor prezentată în Fig. suplimentară S3. Pătratul alb arată dimensiunea relativă a imaginilor care au fost utilizate pentru datele de procesare a imaginilor prezentate în Fig. 2 și în Fig. Suplimentară S2.

A fost calculată o structură tridimensională pentru trimerul de spike GP in situ, în interiorul învelișului viral, cu o rezoluție de 11 Å (Figurile 2 și 3, Fig. Suplimentară S4), utilizând procedura de potrivire a proiecției pe imagini mascate31,32. Am reușit să fixăm structura atomică a GP a EBOV (5JQ7) care conține domeniile GP1 și GP2 în lungime completă, dar cu domeniile asemănătoare mucinei trunchiate (Fig. 2b). Acest lucru demonstrează în mod clar o serie de caracteristici ale vârfului derivat din virus, inclusiv structura și dispunerea domeniilor asemănătoare mucinei în raport cu structura GP1-GP2. În special, baza vârfului, formată din domeniile de fuziune GP2 cu motive repetate heptad, se potrivește extrem de bine: structura de rezoluție atomică 5JQ7 umple volumul structurii noastre crio-EM 3-D (Fig. 2a). Apropierea potrivirii, în special în zona tulpinii sau a „gâtului” trimerului GP, este evidentă atunci când structura spike este afișată la o densitate în care natura bistratului de 5 nm grosime a învelișului virionului este clar vizibilă (Figurile 2a,c și 3a) și, de asemenea, atunci când suprafața este trunchiată la un nivel la care volumul se apropie de o greutate moleculară de 310 kDa (Figurile 2 și 3b). Heliadele alfa ale GP2 sunt vizibile la baza vârfului, (Fig. 2a), iar atunci când reconstrucția este afișată la un nivel de contur ușor mai ridicat, sunt vizibile densitățile care traversează interiorul membranei (Fig. 2c). Deoarece capetele N-terminale ale domeniilor alfa-5 GP2 andocate (2EBO24) par să se alinieze cu aceste densități transmembranare, acestea din urmă pot fi o indicație a regiunilor transmembranare alfa-helicoidale hidrofobe putative ale GP2 (Fig. 2c). Utilizând masa prezisă a GP (așa cum a fost măsurată prin electroforeza pe gel a GP33 derivată din virion), am ajustat volumul structurii 3-D din Fig. 2, folosind o valoare de 0,8 Da/Å3 ca densitate aproximativă pentru proteină34. Având în vedere că structura 5JQ7 are 163 kDa35, domeniile trunchiate asemănătoare mucinei și transmembranare, inclusiv glicanii, reprezintă ~150-170 kDa, aproximativ jumătate din masa vârfului. Când este privit de sus, spicul GP arată ca o elice cu trei pale (figurile 2a și 3b). Lungimea celor trei „lame” cuprinde un cerc cu un diametru de 18 nm. Atunci când este privit din lateral, spicul GP are o regiune de tulpină adiacentă învelișului viral, care se întinde apoi în partea superioară a spicului GP. „Buzunarul” sau „tunelul” de legare a toremifenului identificat la 5JQ7 se află aproape de suprafața structurii EM 3-D, pe partea laterală a tulpinii, la baza elicelor (figurile 2a și 3b). La baza tulpinii din Fig. 2a, cele trei elice repetate heptadice de la baza GP2 se potrivesc perfect în trei fire vizibile în structura noastră EM 3-D, care par să pătrundă în membrana virionului (Figurile 2a și 3a). De asemenea, atunci când este privită de sus, fiecare lamă are un nod mai mic, mai aproape de axa celor 3 pliuri, care iese în afară (Figurile 2a și 3b). Utilizând nivelul de contur de 332 kDa, aceste noduri corespund îndeaproape cu situsul de legare a receptorului, acoperind majoritatea reziduurilor cunoscute ca fiind implicate în legare, precum și ieșind adiacent regiunilor de acoperire glicanică. Fiecare lamă de elice, despre care se știe că conține domeniul asemănător mucinei28 , acoperă complet situsul despre care se știe că se leagă la receptorul NPC-1 (Fig. 3b). Astfel, aproximativ jumătate din masa din structura noastră, în afara învelișului, reprezintă domeniile asemănătoare mucinei. Atunci când harta de densitate este conturată la un nivel care elimină de la afișare bistratul lipidic, tulpina încă se conformează îndeaproape suprafeței structurii cu rezoluție atomică, în timp ce acolo capetele distale ale lamelelor și „nodurile” capacului glicanic sunt ușor trunchiate. Acest lucru indică faptul că aceste regiuni ale structurii au probabil o densitate mai mică, în concordanță cu faptul că sunt puternic glicozilate, așa cum prevede secvența de aminoacizi a domeniului asemănător mucinei. de asemenea, am andocat structura 5JNX36, care include o parte din glicoproteina scindată (GPcl) în complex cu NPC1 uman de lungime completă, și am suprapus structura de rezoluție atomică pe un monomer utilizând modulul de program „Fit in Map” din UCSF Chimera (Fig. 3a). Acest lucru indică faptul că domeniul asemănător mucinei, (toată densitatea neocupată rămasă în structura EM 3-D atunci când GP1-GP2 sunt montate) acoperă complet capacul glicanic, cu nodul de pe partea laterală a elicei acoperind cea mai mare parte, dacă nu chiar tot, situsul de legare a receptorului (Fig. 3a), indicând că îndepărtarea sau scindarea domeniului asemănător mucinei (incluzând probabil nodulul), precum și a capacului glicanic, pot fi condiții prealabile pentru ca legarea receptorului să fie realizată. Structura 5JNX andocată include, de asemenea, regiunea transmembranară a NPC1 și, astfel, am aliniat planul aproximativ al membranei plasmatice atunci când vârful GP se andochează cu receptorul NPC1, prezentat în albastru transparent în Fig. 3a. În absența oricărei curbări a membranei endosomale pentru a acomoda conturul trimerului GP și al complexului NPC1, planul membranei plasmatice ar face un unghi de aproximativ 18 grade față de membrana virală atunci când spike-ul este perpendicular pe învelișul viral (Fig. 3a). Acest lucru este în concordanță cu sugestia lui Gong et al.36 că, probabil, doar un singur loc de legare a receptorului NPC1 din cele trei de pe fiecare trimer poate fi ocupat în același timp și că legarea la mai mult de un receptor ar putea fi împiedicată din cauza interferenței stearic. Posibila linie de clivaj care delimitează domeniul asemănător mucinei și capacul glicanic de restul trimerului este prezentată în Fig. 3a și b. Structura noastră sugerează că domeniul asemănător mucinei și capacul glicanic ar putea fi scindat în același timp, deoarece acesta din urmă se află în întregime în interiorul densității domeniului presupus asemănător mucinei, și este în concordanță cu o greutate moleculară pentru domeniul asemănător mucinei de aproximativ 50 kDa, care este similară cu cea prezisă de secvență, precum și de electroforeza pe gel, deși lungimea lanțurilor laterale de zahăr este încă necunoscută. În plus, am ajustat structurile de rezoluție atomică ale anticorpului Fab-GP care se leagă la fiecare dintre cei doi epitopi principali de neutralizare a GP de EBOV care au fost investigați anterior, MR78 (3X2D15) și KZ52 (3CSY18): (Fig. 3c). Acest lucru indică faptul că, în limitele rezoluției atinse în structura noastră 3-D a spike-ului in situ în înveliș, este puțin probabil ca domeniul putativ asemănător mucinei (probabil alcătuit din paleta de elice și, eventual, din caracteristicile nub descrise aici) să interfereze sau să împiedice în mod stearhic oricare dintre aceste situsuri de neutralizare a anticorpilor, în concordanță cu faptul că neutralizarea este posibilă înainte de scindarea domeniului asemănător mucinei în endosom. Este clar că structura noastră diferă de structurile EM 3-D ale vârfului GP Ebola GP exprimat heterologat, observat in situ în membrana plasmatică, publicate anterior de noi și de alții (Fig. 4). Ambele structuri au inclus material exprimat prin inginerie, folosind proteine mutante sau parțial trunchiate de secvență realizate în particule asemănătoare virusului. Structura spike a lui Beniac et al imaginată în cadrul particulelor asemănătoare virusului a fost cumva decupată, deoarece aceasta ar fi trebuit să includă domeniile asemănătoare mucinei: în plus, tomografia a fost combinată cu analiza unei singure particule, ceea ce ar fi putut denatura rezultatele4. Structura pe care o raportăm aici se bazează în întregime pe metoda bine acceptată de analiză a particulelor unice folosind potrivirea proiecției și este în mare parte similară cu cea publicată a GP exprimată în particule asemănătoare virusurilor cu ajutorul tomografiei28,29: există diferențe notabile în ceea ce privește forma și dimensiunea vârfului, precum și în ceea ce privește rezoluția (Fig. 4). Structurile cu rezoluție atomică determinate anterior ale GP par să se încadreze bine în structura crio-EM pe care o raportăm aici (figurile 2 și 3), iar rezoluția, deși modestă (11 Å), reprezintă o îmbunătățire în comparație cu ~25 Å pentru structurile generate doar prin tomografie, care par să aibă o formă ușor diferită (Fig. 4). În timp ce structura noastră arată o lungime a vârfului de 13 nm și o lungime a tulpinii de 5 nm și o lățime de 3,5 nm, structurile tomografice arată o lungime a vârfului de 14 nm, cu o regiune a tulpinii mai ciupită, mai scurtă și mai îngustă, cu o lungime de 2,5 nm și o lățime de 3 nm, în timp ce învelișul virionului de la bază pare, de asemenea, să fie înclinat departe de tulpina GP (Fig. 4). Structura noastră delimitează în mod clar bistratul de 5 nm al învelișului virionului (care are o spațiere internă de aproximativ 35 Å, Fig. 4a), precum și elicele alfa ale domeniilor de repetare a heptadelor (care au un diametru de aproximativ 12 Å) și caracteristica nub de la baza elicelor, în timp ce aceste caracteristici nu au fost perceptibile în structurile anterioare28,29 (Fig. 4b). Aceste neconcordanțe s-ar putea datora diferențelor dintre materialele exprimate și cele virale, dintre care cel din urmă a fost utilizat în prezentul raport. Diferențele dintre metodele utilizate ar putea fi, de asemenea, semnificative, iar un factor care a contribuit la îmbunătățirea rezoluției a fost utilizarea unei măști în formă de T de dimensiuni optime și selectarea unor regiuni drepte ale membranei virionului pentru analiză (Figura suplimentară S3). Acest lucru a permis o aliniere și o selecție precisă a imaginilor luate în unghi drept față de axa triplă a spițelor, obținând în același timp o acoperire excelentă a vederilor laterale, deoarece spițele sunt distribuite aleatoriu pe axele lor triple, folosind unghiuri Euler de 0-120 grade de rotație în jurul axei Z (deoarece este un trimer). Astfel, am evitat „pană lipsă” de informații asociată cu tomografia, unde constrângerea unghiului de înclinare limitează distribuția unghiulară a vederilor. Analizele noastre nu au evidențiat nicio simetrie longitudinală sau periodicitate bine ordonată a vârfurilor GP de-a lungul axei filamentului virionului, ceea ce arată că dispunerea vârfurilor de virioni poate să nu urmeze o simetrie rigidă. De asemenea, nu a fost evidențiată nicio simetrie longitudinală în stratul de matrice VP40 al virionului (deși a fost observată o spațiere a rețelei de 5 nm în stratul VP40 în imaginile care prezintă o vedere perpendiculară a membranei VLP4). Am arătat că vârfurile GP ale virionilor EBOV au probabil o spațiere inconsistentă sau variabilă, similară cu cea demonstrată anterior pentru VLP-urile EBOV (Fig. suplimentară S3). De asemenea, am confirmat rezultatele anterioare4 care arată că stratul de nucleocapsidă al virionilor menține o spațiere longitudinală ordonată constantă de aproximativ 7 nm (Fig. suplimentară S3), în ciuda curbelor și curbelor filamentului. Astfel, orice contacte între GP și VP40 și/sau proteinele nucleocapsidei pot fi variabile și neechivalente: sau, dacă există o aliniere și o stoichiometrie preferată, aceasta nu a putut fi detectată prin crio-EM a virionilor întregi cu datele noastre actuale.

Figura 2: Structura 3D a vârfului EBOV.

(a) Trimerul GP cu structura GP1-GP2 andocată 5JQ7 prezentată din diferite perspective. Schema de culori pentru reconstrucția 3D este următoarea: portocaliu, capătul distal al vârfului GP; galben, corpul vârfului GP; verde, tulpina vârfului GP; și albastru, integrat în învelișul viral. Cele trei subunități GP1-GP2 din 5JQ7 sunt colorate în albastru, verde și galben, iar toremifena în roșu. (b) Reprezentări de suprafață și panglică ale 5JQ7 pentru comparație cu (a): Extremitățile C-terminale ale GP2 sunt indicate prin săgeți. (c) Densitățile transmembranare vizibile în reconstrucția filtrată cu filtru trece-jos de 13,4 Å (săgeată roșie, în stânga) se aliniază cu heptadele alfa-helice repetate ale structurii de bază 2EBO a GP2 andocate (dreapta: puncte roșii).

Figura 3: Îmbinarea structurilor 3D de crio-EM și de rezoluție atomică.

(a) Structurile de rezoluție atomică 5JQ7 și 5JNX (NPC1-GP, magenta) au fost andocate în cadrul Ebola GP folosind Chimera (subunitățile trimerice GP colorate în verde, albastru și galben; NPC1-GP în magenta). Reconstrucția crio-EM este prezentată la un prag pentru a arăta învelișul viral și folosind același cod de culori ca în Fig. 2. (b) Reconstrucția vârfului GP este prezentată la un prag echivalent cu masa sa moleculară pentru a ilustra ajustarea strânsă a 5JQ7. Inset-ul arată localizarea toremifenului (roșu), iar reziduurile situsului de legare a receptorului sunt colorate în roșu. (c) Structurile de rezoluție atomică ale anticorpilor neutralizanți KZ52 Fab (3CSY, bej), MR78 Fab, (3X2D, roz) au fost andocate în cadrul Ebola GP folosind Chimera.

Figura 4: Comparație între structurile vârfurilor de Ebola legate de membrana virală.

Structura derivată dintr-o singură particulă prezentată în această investigație (a) este comparată cu o structură calculată cu ajutorul analizei sub-tomogramei (b). Reconstrucțiile crio-EM sunt prezentate folosind același cod de culori ca în Fig. 2.

În concluzie, structura actuală este în concordanță cu domeniul asemănător mucinei care oclude capacul glicanic și regiunea de legare a receptorului, astfel încât este necesară scindarea pentru funcționarea acestuia din urmă în endosom pentru a descoperi situsul de legare a receptorului pe GP113,17,20,21,22. Este probabil că scindarea capacului glicanic include, de asemenea, îndepărtarea atât a structurilor „elice”, cât și a structurii „nub” descrise aici. Este clar că densitatea din structura noastră acoperă parțial domeniul de legare a receptorului și ar inhiba probabil legarea NPC-1 până când are loc scindarea domeniului asemănător mucinei. Pentru a răspunde la aceste întrebări și pentru a progresa în cunoașterea morfogenezei EBOV sunt necesare studii suplimentare de înaltă rezoluție ale structurii GP derivate din virus și ale particulelor de virion. În studiile viitoare, analizele privind dispunerea spațială a vârfurilor în membrană, dispunerea structurală a domeniilor transmembranare și citoplasmatice, precum și analiza conexiunilor flexibile, cvasi-echivalente dintre proteina VP40 a matricei învelișului și nucleocapsida, toate acestea vor fi importante pentru a continua înțelegerea modului în care aceste componente virale funcționează în ciclul de replicare a EBOV.

.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.